作者:James BadhamSanta Barbara, CA
要想加深我们对人脑的理解，就需要对包括实验室小鼠在内的哺乳动物的神经回路如何工作有新的认识。这些研究需要用分辨率足够高的显微镜来监测大脑活动，以便观察单个神经元和它们的邻居。
双光子荧光显微技术已经大大提高了研究人员的能力，而加州大学圣巴巴拉分校电子与计算机工程系副教授Spencer LaVere Smith的实验室，是推进这项技术研究的温床。作为美国国家科学基金四川凉山新增1例无症状感染者会资助的新一代多光子神经成像联盟(Nemonic)中心的首席研究员，该中心由奥巴马总统的大脑计划创立，总部设在加州大学圣保罗分校(UCSB)，史密斯致力于“推动神经科学研究中多光子显微镜的前沿”。
在11月17日的《自然通讯》(Nature Communications)杂志上，Smith和他的合著者报告了一种新型显微镜的开发，他们将其描述为“用于大视场双光子成像的双独立增强扫描引擎(Diesel2p)”。他们的双光子显微镜提供了前所未有的脑成像能力。该设备拥有任何此类设备中最大的视场(高达25平方毫米)，使其能够提供大脑多个区域的亚细胞分辨率。
史密斯解释说:“我们正在优化三件事:看到单个神经元的分辨率，同时捕捉多个大脑区域的视野，以及捕捉行为中神经元活动的变化的成像速度。”“我们感兴趣的成像事件持续不到一秒，所以我们没有时间移动显微镜;我们必须一次拍摄所有的东西，同时仍要确保光学系统能够聚焦超快脉冲激光。”
驱动双光子成像系统的大功率激光器，每台成本约为25万美元，能产生超快、超强的光脉冲，每台激光器的亮度超过阳光的10亿倍，持续时间为0.0001纳秒。每秒8000万次脉冲的单一光束被分成两个完全独立的扫描引擎臂，使显微镜能够同时扫描两个区域，每个区域配置不同的成像参数。
在该仪器的前几次迭代中，两个激光器被连接并配置为相同的参数，这种安排强烈地限制了采样。最佳扫描参数，如帧速率和扫描区域大小，因分布式神经电路和实验要求而异，新仪器允许对两束光束使用不同的扫描参数。这种新设备包含了多种定制设计和定制制造的元件，包括光学继电器、扫描透镜、管状透镜和物镜。由扬中棋牌游戏中心于其能够在广泛分散的大脑区域提供神经活动的高速成像，它已经被广泛采用。
史密斯致力于确保仪器的开放获取。早在这篇新论文发表之前，他和他的合著者就发布了一份预印本，其中包括复制这篇论文所需的工程细节。他们还与波士顿大学(Boston University)的同事分享了这项技术。在波士顿大学，陈杰(Jerry Chen)实验室的研究人员已经对这项技术进行了修改，以适应他们自己的实验。
“这令人兴奋，”史密斯说。“他们不需要像我们一样从零开始。他们可以在我们的基础上建造。Jerry的论文与我们的论文接连发表，两家公司INSS和CoSys已经出售了基于我们设计的系统。因为这项技术没有专利，将来也不会有，所以所有人都可以自由使用和修改他们认为合适的技术。”
双光子显微镜是荧光显微镜的一种特殊类型。为了在史密斯的实验室中进行这项工作，研究人员对老鼠进行基因改造，使它们的神经元含有一种神经元活动的荧光指示器。该指示剂是将水母的荧光蛋白和自然界存在的钙结合蛋白结合而成的。这种方法利用了神经元放电时短暂的、数量级的钙增加。当激光指向神经元时，神经元放电，钙离子进来，蛋白质找到钙离子，最终发出荧光。
双光子成像通过利用光子的量子行为，在某种程度上防止产生大量的失焦荧光光，从而增强了荧光显微镜。在普通的光学显微镜中，来自激发样品的光源的光以一种方式进入样品，这种方式产生一个垂直的光锥，使其缩小到目标焦点区域，然后在该点以下形成一个倒锥。任何不在最窄点上的光都是失焦的。
双光子显微镜中的光表现不同，它产生www e12 com cn了一个聚焦的单点(没有光锥)，消除了所有到达成像透镜的失焦光。史密斯解释说:“这张照片只显示了我们正在观察的那架飞机的光线，而没有太多来自飞机上下的背景信号。”“大脑具有光学特性和像黄油一样的质地;它充满了脂质和水溶液，使它很难被看穿。在正常的光学成像中，你只能看到大脑的顶部。双光子成像使我们能够更深入地成像，并仍然达到亚细胞分辨率。”
双光子激发光的另一个优点是它使用低能量、长波长的光(在近红外范围内)。这种光在穿过组织时散射更少，所以它可以在组织深处敏锐地聚焦。此外，较低能量的光对样品的损害小于较短波长的光，如紫外线。
史密斯的实验室在老鼠身上测试了这种设备，观察它们执行任务时的大脑，比如观看视频或在虚拟现实环境中导飞飞外挂航。每只老鼠的头盖骨上都植入了一块玻璃，为显微镜观察其大脑提供了一扇真正的窗户。
他说:“我的动机是试图理解神经回路的计算原理，这让我们可以做一些目前无法在机器上复制的有趣的事情。”“我们可以制造一台机器来做很多比我们更好的事情。但对于其他事情，我们不能。我们训练青少年驾驶汽车，但自动驾驶汽车在许多人类不会的情况下都失败了。我们用于深度学习的系统是基于大脑的洞察力，但它们只是少数的洞察力，而不是全部。它们工作得很好，但仍然很脆弱。相比之下，我可以把一只老鼠放在它从未去过的房间里，它会跑到我够不着的地方。它不会撞到任何墙壁。它能非常可靠地做到这一点，只需要大约一瓦特的功率。
“有一些有趣的计算原理，我们还无法在存在于老鼠大脑中的人造机器中复制，”史密斯继续说，“我想开始揭示这些原理。”这就是为什么我想建造这台显微镜。”